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siRNA合成

siRNA 套餐

 

为了回馈广大客户对本公司的鼎力支持,特推出 RNAi 系列优惠套餐,供广大新老客户选择。

有效性?#20449;?/strong>

 

客户只需提供基因序列 GeneID 或者 Accession number, 我们免费帮您设计选择合适的位点,

siRNA oligo 细胞转染效率达到 70%以上,我们可以保证至少有一对可以有效的抑制相应基因

(mRNA)的表达,抑制效率可达 70%以上.

 

产品描述

目录号

产品名称

规格

纯化方式

交货期限

A10001

普通 siRNA 经济型套餐-A

1

HPLC

6 个工作日

A10002

普通 siRNA 实惠型套餐-B

1

HPLC

6 个工作日

A10003

化学修饰 siRNA 经济型套餐-C

1

HPLC

6 个工作日

A10004

化学修饰 siRNA 实惠型套餐-D

1

HPLC

6 个工作日

A10005

荧光修饰 siRNA 经济型套餐-E

1

HPLC

6 个工作日

A10006

荧光修饰 siRNA 实惠型套餐-F

1

HPLC

6 个工作日

 

普通 siRNA 经济型套餐 A

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

3 对(3×2 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC


普通 siRNA 实惠套餐 B

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

4 对(4×4 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

化学修饰 siRNA 经济套餐 C

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

3 对(3×2 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

化学修饰 siRNA 实惠套餐 D

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

4 对(4×4 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

荧光修饰 siRNA 经济套餐 E

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

3 对(3×2 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

荧光修饰 siRNA 实惠套餐 F

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

4 对(4×4 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

in vivo 化学修饰 siRNA 经济套餐 G(全链甲氧修饰,末端胆固醇修饰)

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

3 对(3×2 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

in vivo 化学修饰 siRNA 实惠套餐 H(全链甲氧修饰,末端胆固醇修饰)

套餐内容

规格

纯化方式

目的基因 siRNA oligos

4 对(4×4 OD)

HPLC

阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

FAM 标记阴性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

阳性对照 siRNA oligos

1 对(1×1 OD)

HPLC

 

实验数据

 

siRNA Real-Time PCR 结果分析

 

对于 RNAi 实验而言,我们通常需要知道的是某一特定细胞在导入 siRNA 前后某一特定基因的

表达变化情况来判断 siRNA 起到了 Gene Knockdown 作用。应用荧光定量 PCR 的方法,可以

通过两种途径来实现上述判断,一是测定特定细胞在导入 siRNA 前后某一特定基因 mRNA 数量

的变化,即为绝对定量;二是通过检测特定基因与某一管家基因在在导入 siRNA 前后相对表达情况的变化,即为相对定量。通常采用相对定量的方法来检测 siRNA 的 Gene Knockdown 作用。

 

1Real-Time PCR 实验设计

 

Real-Time PCR 实验设计时应包括实验组(导入 siRNA),阴性对照(Negative Control)和 Mock Transfaction 三组。每组至少三个重?#30784;?#21508;组同时检测目标基因和管家基因的 Ct 值。下例中以 GAPDH 为管家基因。
 

 

2Real-Time PCR 得到 siRNA 导入前后目标基因和管家基因的 Ct

 

各组重复实验的 Ct 值差异不能过大;一般地,重复实验 Ct 值差异在 1 以内是可以接受的。
 


实验组

 

阴性对照(NC)

Mock Transfection

Target Gene

GAPDH

Target Gene

GAPDH

Target Gene

GAPDH

30.40

23.63

24.21

22.66

26.21

24.60

30.35

23.40

24.60

22.56

26.15

24.31

30.41

23.52

24.66

22.48

26.35

24.72

 

3Real-Time PCR 数据分析

  1. Mock Tansfection 为对照(Calibrator),管家基因为 Normalizer,ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct

 

管家基因)实验组-( Ct 目的基因- Ct 管家基因)对照

 

Target Gene

GAPDH

Ct

Ct

Target Gene

 

 

 

Target

Ct–  C

 

 

Average Ct

Average Ct

Gene–GAPD

 

Rel. to Mock

 

 

 

 

t, Mock

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

Moc

26.24±0.1

24.54±0.2

1.7±0.21

0.00±0.2

1.0(1.16-0.86)

k

0

1

 

1

 

 

 

 

 

 

 

30.39±0.0

23.51±0.1

6.88±0.17

5.18±0.1

 

 

 

 

 

 

 

9*1

5*2

*3

7

031)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NC

24.49±0.2

22.56±0.0

1.93±0.25

0.23±0.2

0.85(0.71-

 

4

9

 

5

1.01)

 

 

使用方法

 

AsiRNA 转染的方法

哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和 polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。

 

应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面:转染试剂的用量、siRNA 的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA 复合物的温浴的时间

 

BLipofectamin2000 转染试剂

选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。

Lipofectamin2000 适用于核酸的体内和体外操作,可应用于 DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA

的转染,?#37096;?#24212;

用于 DNA/siRNA 的共转染操作;是一种新型的高效 siRNA 转染试剂。

 

Lipofectamin2000 的应用领域:

1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染

2、siRNA 高通量转染试验

3、DNA 转染;DNA 和 siRNA 的共转染

4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验

5、贴壁细胞和悬浮细胞转染

 

Lipofectamin2000 的特点:

1、不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作

2、在含血清培养基中也能表现高转染效率

3、细胞毒性低;适用细胞广泛

4、即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染

5、基于脂质的转染试剂,确保没有 RNAse 活性

6、可介导 siRNA 高转染细胞及体内 siRNA 的高效导入

C. Lipofectamin2000 适用的细胞类型

Lipofectamin2000 转染试?#37327;?#24191;泛应用于多种细胞系的 DNA 和 siRNA 转染如:HeLa(?#21496;?#37096;癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎?#19978;?#32500;细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒 5 DNA 转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4 细胞等。

 

D.转染前细胞培养

在细胞板上培养细胞?#20445;?#24212;使细胞汇?#26174;?nbsp;24 小时内达到 70-90%。

 

E.合适的 lipofectamin2000 用量

合适的 siRNA(DNA):lipofetamin2000 比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的 DNA:

lipofetamin2000 为 1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000 为 1:0.01-1:0.1(pmol:

ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。

 

 

F.贴壁细胞转染程序

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA(DNA)和 lipofectamin 的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。

 

1、转染前一天,4-5´104 细胞接种在 24 孔板上,0.5mL 含 FBS 和抗生素的 DMEM(或 Opti-MEM,

其他培养基)细胞培养基。

2、选择用于初期接种的细胞数量,应能在 24 小时内使细胞汇合达到 70-90%。

3、在 50μl 的 DMEM(或 Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入 20pmol siRNA(或

0.8μg DNA),柔和混匀;

4、混匀 lipofectamin 试剂,用 50μl 无血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀

  1. 1μl lipofectamin 试剂(DNA 转染?#20445;?#21017;加入 2μllipofectamin 试剂),轻轻混匀,室温放置 5

 

分钟;

5、将稀释好的 siRNA  和 RNAi-Mate  试剂混合;轻柔混匀,室温放置 20  分钟,以便形成

siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)复合物。

6、将 100μl siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)复合物?#25317;?#21547;有细胞和培养基的培养板

的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。

7、 细胞在 CO2 培养箱中 37℃温育 24h-48h 后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育 4-6 小时后,除去复合物,更换培养基。

G.悬浮细胞转染程序

1、转染的当天,收集细胞离心,用含 FBS 的培养基重悬。

2、在 50μl 的 DMEM(或 Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入 20pmol siRNA(或

0.8μg DNA),柔和混匀;

3、混匀 lipofectamin 试剂,用 50μl 无血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀

  1. 1μl lipofectamin 试剂(DNA 转染?#20445;?#21017;加入 2μl lipofectamin 试剂),轻轻混匀,室温放置 5

 

分钟;

4、将稀释好的 siRNA  和 lipofectamin  试剂混合;轻柔混匀,室温放置 20  分钟,以便形成

siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)复合物。

5、再加入 400μL 细胞悬浮?#28023;?#32454;胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。

6、细胞在 CO2 培养箱中 37℃温育 24h-48h 后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育 4-6 小时后,除去复合物,更换培养基。

 

 

HDNA  siRNA 共转染细胞

1、在转染的前一天,4-5´104 细胞接种在 24 孔板上,0.5 mL 含 FBS 和抗生素的细胞培养基。

2、选择用于初期接种的细胞密度,应能在 24 小时内使细胞汇合达到 70-90%。

3、在 100μL 的无血清的培养基中稀释 20pmol siRNA 和 0.2μg DNA,加入 2μl lipofectamin 试剂,充分混合,放置 20 分钟,以便形成 siRNA/ DNA/lipofectamin 复合物。

4、将 siRNA/ DNA/lipofectamin 复合物加入培养基中,轻轻混?#21462;?

5、细胞在 37℃温育 24h-48h 后,进行转染后的其它步骤。

 

IsiRNA 体内导入方法

1、适量的 siRNA 或 DNA 溶于不含 RNA 酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的 siRNA 或 DNA,一般 DNA 为 2μg /μL、siRNA 为 10μg /μL。

2、取适量的 DNA、siRNA 或 siRNA\DNA 复合物与 lipofectamin 混合。例如,在 1#管中加入

0.5μL 的 DNA(1μg)和 0.5μL 的 siRNA(5μg),在 2#管中加入 0.55μL 的 lipofectamin(24μg)

  1. 0.45μL 不含 RNA 酶的无菌水中,将 1#管中的溶液加入 2#管中,在室温下温育 30 分钟,以形成 siRNA/DNA-lipofectamin 复合物。

 

3、制备的 siRNA/DNA-lipofectamine 复合物可用于体内导入 siRNA、DNA 或 siRNA\DNA。

北京pk10为何先赢后输